Однако на пути
внедрения методов лечения с помощью ИПСК оказалось немало «подводных камней» (([xx] ,[xxi], [xxii]).
Выяснилось, что перепрограммирование клеток может быть недостаточно эффективным
([xxiii])
или индуцировать мутации ([xxiv], [xxv], [xxvi]).
Перепрограммированные клетки не могут развиться в некоторые типы клеток ([xxvii]).
В некоторых случаях ИПСК вызывают иммунные
реакции, когда они трансплантированы обратно в организм ([xxviii], [xxix], [xxx]).
Но, что самое главное, все 4 перепрограммирующих фактора Oct4, Klf4, Sox2
и в особенности c-Myc,
являются онкогенами способными индуцировать раковое
перерождение клеток ([xxxi]).
Поэтому плюрипотентность и способность к образованию
опухолей тесно связанные особенности плюрипотентных стволовых клеток. У
взрослого человека и других млекопитающих трансплантация плюрипотентных или эмбриональных
стволовых клеток обычно
приводит к образованию тератомы ([xxxii])
– опухоли в которой представлено множество разновидностей дифференцированной
ткани вперемешку со
стволовыми клетками -
которая затем может превратиться в злокачественную опухоль – тератокарциному ([xxxiii]). Если, однако, поместить клетки
тератокарциномы в ранний зародыш млекопитающего (на стадии бластоцисты), то они
включаются в состав клеточной массы бластоцисты и из такого химерного (то есть состоящего из клеток от
разных организмов) эмбриона нередко развивается нормальное химерное животное.
Почти во всех органах и тканях таких животных часть дифференцированных клеток
происходит из клеток тератокарциномы, которые совместно с клетками нормального
происхождения участвуют в построении здорового организма ([xxxiv], [xxxv]).
Учитывая то, что по данным цитогенетического анализа, тератокарциномы, как
правило, не являются результатом мутации ([xxxvi])
- их образование, очевидно, связано со «сбоем» морфогенеза из-за возрастного
несоответствия этапов эпигенетической программы развития ткани взрослых
млекопитающих с начальным на котором находятся эмбриональные стволовые клетки и
ИПСК.
Возможно, что это взаимодействие
ткани взрослых млекопитающих с эмбриональными стволовыми клетками, приводящее к
«сбою» программы морфогенеза из-за возрастного несоответствия, обусловлено
биомаркировкой возрастных
изменений с помощью специальных микроРНК. В роли таких биомаркеров ([xxxvii])
могут выступать так называемые онкогенные миРНК, такие как, например miR-19, и
некоторые другие члены кластера miR-17-92 ([xxxviii]),
а также микро РНК miR-302–367
([xxxix]). Не исключена и эпигенетическая
маркировка путем, например, метилирования ДНК ([xl])
или ферментативных модификаций гистонов, приводящих к изменению набора
специфических маркеров на поверхности клетки (145).
Организм, у которого
активно обновляются ткани, рискует заболеть из-за чрезмерной пролиферации его
клеток. Худшим вариантом такого заболевания является рак. К счастью, внутренняя иммунная система
организма, включая такие ее составные как клетки-киллеры и система
комплемента способны, как оказалось, избирательно удалять недифференцированные
клетки, что значительно понижает риск образования опухолей у реципиентов, не
страдающих от иммунодефицита. Этому
риску также противостоят механизмы подавления опухолевого роста. Одним из таких
механизмов является ускоренное старение дефектных клеток. В этом механизме
задействованы: сигнальный путь регулируемый белком p53 ([xli]) и сигнальный путь регулируемый
белками pRb и p16 Ink4a ([xlii], [xliii]). Мутации в этих белках значительно
повышают риск развития рака ([xliv]).
Вместе с тем именно эти белки играют важнейшую роль в ограничении способности
клетки к неограниченному делению ([xlv] , [xlvi])
и перепрограммированию в ИПСК ([xlvii], [xlviii] ). Обнадеживают и данные о том,
что в организме есть гены, которые предотвращают превращение стволовых клеток в
раковые. Эту роль выполняет ген Sept4 кодирующий
белок ARTS. Белок ARTS
обычно локализующийся в митохондриях ([xlix] ),
инактивирует белки предотвращающие гибель клеток от апоптоза (программируемой
клеточной гибели) ([l]) и
таким образом повышает апоптоз ( [li]). Мыши лишенные ARTS образуют опухоли в два раза чаще, чем
нормальные.
Тем не менее, несмотря на
вышесказанное, способность ИПСК к образованию различных опухолей является
главным препятствием на пути внедрения клеточной терапии в клиническую практику
([lii], [liii]) Поэтому важно перед
трансплантацией клеток проводить их дифференцировку и трансплантировать не
ИПСК, а дифференцированные клетки. Универсальные методы для такой дифференцировки
уже имеются ([liv]). Тот факт, что ИПСК человека способны к
образованию тератом не только в теле человека, но и в организме некоторых
животных, в частности в организме свиней, позволил разработать метод дифференцировки
ИПСК в условиях in vivo. Для
этого ИПСК вводят генмодифицированной свинье, у которой подавлена активация
иммунной системы на клетки человека ([lv]),
а затем, вырезав образовавшуюся тератому, выделяют из нее необходимые
дифференцированные клетки ([lvi]),
используя моноклональные антитела к тканеспецифичным маркерам на поверхности
клеток Опухоли
обладают удивительной способностью поддерживать необходимую им пропорцию
клеточных субпопуляций путем превращения имеющихся клеток в те клетки, число
которых сократилось ниже необходимого уровня. Так, при избирательном удалении
раковых стволовых клеток в результате антираковой терапии, они вновь довольно
быстро возникают путем превращения дифференцированных клеток обратно в стволовые,
что ведет к возобновлению роста опухоли ([ia]). Рис 1 . Поэтому очень важно перед трансплантацией
клеток полученных из тератомы не только очистить их с помощью «коктейля»
антител ([iia]) к поверхностным
антигенам плюрипотентности (SSEA-5; CD9;
CD90) от недифференцированных плюрипотентных
стволовых клеток, способных дать начало
новой тератоме, но и предотвратить возможность трансформации дифференцированных
клеток обратно в стволовые. Этого можно достичь, например, с помощью
ингибирования синтеза транскрипционного фактора FOXO1, который необходим для поддержания синтеза факторов плюрипотенции: OCT4, NANOG, и SOX2.
Ингибирование FOXO1 путем преинкубации клеток со специальными
интерференционными РНК предотвращает образование тератомы in vivo ([iiia]). см. Рис 3.2.1 Были разработаны методы, при которых
вероятность раковой трансформации клеток значительно ниже, чем в методике
Такахаши и Яманака. Недостатком большинства из этих методов является очень
низкая эффективность перепрограммирования ([lvii]).
Так например, метод перепрограммирования путем прямой доставки перепрограммирующих
белков в клетки имеет эффективность на порядок ниже, чем методика Такахаши и
Яманака ([lviii]).
Совсем недавно, однако появилась модификация методики Яманаки, которая за счет
использования в сочетании с факторами Oct3/4, Sox2 и Klf4 вместо онкогена
c-Myc транскрипционного
фактора Glis1 ([lix]), позволила поднять
эффективность транскрипции в 10 раз ([lx]). По утверждению авторов Glis1, которым
обычно обогащены неоплодотворенные яйцеклетки и эмбрионы на стадии одной
клетки, значительно снижает риск раковой трансформации, так как предотвращает
репродукцию клеток, которые не смогли полностью преобразоваться в ИПСК. Такие
несовершенные клетки трудно отличить от качественных ИПСК, но они имеют более
высокий риск раковой трансформации. Особенностью Glis1
является его способность связываться с γ-рецептором ретиноевой кислоты RORγ, который, как известно,
регулирует «часовые» гены (clock-controlled genes), в частности регулятор
клеточного цикла p21 ([lxi]).
Избежать осложнений связанных с плюрипотентностью стволовых клеток, возможно,
помогут белки FOXO, которые известны своей способностью подавлять образование
опухолей. Обнаружено, что ингибирование матричной РНК кодирующей FOXO1 с
помощью коротких шпилек интерферирующей РНК приводит к более чем 90% подавлению синтеза белка FOXO1 в
клеточной культуре, которое сопровождалось снижением синтеза OCT4, NANOG, и SOX2,
а также потерей стволовыми клетками поверхностных маркеров плюрипотенции. Трансплантация мышам с иммунодефицитом
человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) обычно приводит к
образованию тератомы содержащей клетки всех трех эмбриональных зародышевых
листов (что рассматривается как доказательство их плюрипотентности in vivo). Однако
при инъекции клеток, предварительно обработанных с целью подавления синтеза
белка FOXO1, только у двух из девяти животных были отмечены тератомы, да и те сравнительно небольшие. ([lxii]).
Такой метод,
позволяющий убрать из клеток факторы, использованные при перепрограммировании
непосредственно в организме – in vivo, если удастся
повысить его эффективность, можно будет сочетать с методами
перепрограммирования клеток непосредственно в организме. Такими как например,
метод перепрограммирования in vivo некоторых из составляющих более 90- 95% экзокринных клеток поджелудочной железы в β-клетки производящие инсулин ([lxiii]).
Недостатком этого потенциально очень перспективного метода (из-за простоты его
исполнения – сделал инъекцию и готово) является то, что для доставки
в целевые клетки, необходимых для
трансдифференцировки клетки факторов транскрипции (нейрогенина (Ngn3), активатора генов инсулина и
соматотропина (Pdx1) и Mafa – фактора
связывающего активатор инсулинового гена β-клетки RIPE3b), используются вирусы
и вероятность образования опухоли в результате такого лечения весьма высока ([lxiv]). Далее см. Использование микро РНК для перепрограммирования
соматических клеток
|