Среда, 12.12.2018
БИОРЕГЕНЕРАЦИЯ
Меню сайта
Категории раздела
Мои файлы [33]
Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0
Форма входа
Главная » Файлы » Мои файлы

Целенаправленное редактирование генов в ИПСК с помощью «молекулярных ножниц».
[ Скачать с сервера (141.0 Kb) ] 21.10.2011, 21:58

Весьма заманчива перспектива использования технологии генной терапии с помощью ИПСК. ИПСК предоставляют уникальную возможность взять небольшой образец соматических клеток у пациента (из кожи или клеток мочи) и, перепрограммировав их в ИПСК  произвести неограниченное количество клеток путем культивации. Затем исправить их, внедрив в геном «терапевтические гены», которые возьмут на себя функции генов, которые отсутствуют или неисправно функционируют у пациента. Такие исправленные ИПСК можно далее использовать для автологичной клеточной терапии путем репопуляции пораженных тканей ([i]). Таким образом, корректируя геном, можно будет лечить наследственные болезни вызванные мутацией.

Эффективная генная терапия стала возможной после разработки сравнительно безопасных методов доставки в клетку желаемых инородных генов с минимальным риском побочных результатов. Одним из способов доставки или вырезания генетических конструкций является использование ДНК рекомбиназ – ферментов катализирующих рекомбинацию между молекулами ДНК ([ii]). Так, Cre рекомбиназа, получаемая из бактериофага P1,  осуществляет гомологичную рекомбинацию между последовательностями известными как LoxP сайты ([iii]). Последовательность ДНК заключенная между прямыми повторами LoxP сайтов при рекомбинации осуществляемой Cre рекомбиназой вырезается ([iv]). Доставить Cre рекомбиназу в ядро можно с помощью бактерий Pseudomonas aeruginosa , которые обладают секреторной системой типа III  (a type III secretion system - T3SS).  Эта система позволяет им впрыскивать непосредственно в клетку токсичные белки с N-концевой сигнальной последовательностью,  диктующей клетке, что данный белок должен быть доставлен в ядро ([v]).  Используя Cre рекомбиназу ([vi]) с последовательностью ядерной локализации (Cre recombinase containing a nuclear localization sequence -  Cre-NLS) можно проводить рекомбинацию просто заражая клетки.  При этом простое добавление антибиотика полностью уничтожает все бактериальные клетки.  Такой метод, позволяет, к примеру, убрать из клеток кассету с факторами, использованными при перепрограммировании непосредственно в организме – in vivo ([vii]).

Иногда Cre рекомбиназу используют совместно с Помощник-зависимым аденовирусным вектором Helper-dependent adenoviral vector (HdAd), который получают путем удаления всех вирусных генов оставляя только обратные (инвертированные) концевые повторы, необходимые для размножения, и последовательность Ψ необходимую для упаковки. Такая стратегия полностью исключает образование токсичных вирусных белков в зараженной клетке ([viii]).

Привлекательным методом невирусной доставки генов, который позволяет эффективно встраивать желаемую ДНК в геном различных клеток является использование транспозонов – сложных структур содержащих дискретные куски ДНК, обладающие способностью изменять свое местоположение в геноме посредством механизма транспозиции (инсерции), вынуждающего его включиться или наоборот покинуть определенный участок генома ([ix] ,[x]). Транспозон состоит из инсерционных сегментов ДНК, которые могут перемещаться как единое целое, захватывая лежащие между ними гены.Рис 6,  Рис 5. Поэтому перемещение генов с помощью  транспозонов является многообещающим подходом к решению задач генной терапии. Описано несколько транспозонных систем пригодных для транспортировки генов в клетки млекопитающих. Это «Спящая красавица» - Sleeping Beauty (SB) ([xi]) и его гиперактивный вариант SB100X ([xii]), «Жадный Бак» - PiggyBac (PB) и Tol2 ([xiii]).    

Так, например, PB был использован для выработки ИПСК путем доставки с его помощью кассеты генов кодирующих факторы перепрограммирования c-Myc, Klf4, Oct4 и Sox2 в соматические клетки ([xiv] ). Последующая de novo активация синтеза PB транспосазы (кодируемого самим транспозоном фермента катализирующего разрыв и воссоединение цепей ДНК) приводила к бесследному удалению репрограммирующей кассеты  ([xv]), что является бесспорным преимуществом т.к. оставаясь в геноме клетки такой вектор, мог бы вызвать непредсказуемые нарушения в работе генов.  Недостатком этой методики получения ИПСК является низкая эффективность и возможность мобилизации эндогенных транспозонов. Позднее была разработана более эффективная методика ([xvi]) получения ИПСК мыши и человека введением в соматические клетки векторов на основе PiggyBac (PB) с кассетой из ДНК кодирующей 6 факторов (Oct4, c-Myc, Klf4,  Sox2 плюс Rarg (retinoic acid receptor gamma - RAR-γ) и Lrh-1 (liver receptor homologue 1; Nr5a2). Этот метод позволил сократить продолжительность перепрограммирования до 4-12 дней и поднять его эффективность до уровня сопоставимого с методами переноса ядер ([xvii]) и слияния клеток ([xviii]). Добавление Rarg –{ гамма рецептора ретиноевой кислоты (карбоновой кислоты витамина А ([xix]), при недостаточности которого резко снижается образование гликопептидов содержащих фукозу ([xx]) – маркер стволовых клеток ([xxi]))} и действующего синергично с ним Lrh-1 ([xxii]) -  {печеночного рецептора гомолога 1,  называемого также  Sf-1  -  steroidogenicfactor-1 стероидогенным фактором 1 и являющегося членом семейства  Nr5a  - ядерных рецепторов  стероидных гормонов} необходимо для образования  гетеродимера  RargLrh1, который, конкурируя против COUP-TF  ([xxiii]) за RAREoct (retinoic acid-responsive elements)  локализованные в промотор усиливающем участке гена Oct4 ([xxiv], [xxv]), поддерживает синтез эндогенного Oct4.

            Успехи белковой инженерии позволили создать методы конструирования искусственных цинк-палец нуклеаз или как их называют в английском звучании цинк-фингер нуклеаз – ZFN ([xxvi]). ZFN являются искусственными рестрикционными ферментами, получаемыми путем внедрения селективно связывающих ДНК доменов, называемых «цинк-палец», в расщепляющий ДНК домен неспецифичной рестрикционной эндонуклеазы FokI ([xxvii]), который должен быть удвоен (димеризован) для того чтобы создать разрывы в обеих цепях двухцепочечной ДНК..

  Домен цинк-палец представляет собой белковую структуру, которая координирует положение ионов цинка. Он может быть спроектирован таким образом, чтобы узнавать необходимую последовательность ДНК.  ZFN позволяют редактировать геном, вызывая целенаправленные разрывы в двухцепочечной ДНК. Двухцепочечный разрыв, позволяет осуществить в участке-мишени ZFN мутагенез в результате стимулируемой таким образом природной репарации ДНК, а именно гомологичной рекомбинации и негомологичного соединения концов (Non-Homologous End Joining - NHEJ).   Обычно типичная ZFN содержит от 2х до 6 «индивидуальных» цинк-пальцев и, в зависимости от количества пальцев, способна связывать участки ДНК длиной от 5-ти до 18 пар оснований ([xxviii], [xxix]). Подобрав достаточно редкие последовательности ДНК в качестве мишени ZFN можно снизить нежелательную возможность разрезания участков, не предусмотренных в качестве мишени для нуклеаз ([xxx]). 

Кроме ZFN методами биоинженериии получены искусственные транскрипционные факторы, цинк-палец метиллазы, цинк-палец рекомбиназы. Разрабатываются и другие биоинженерные нуклеазы, например нуклеазы с ориентируемые доменомTAL  (Transcription Activator-Like Effector Nucleases - TALENs)([xxxi], [xxxii]). Домен TAL (TAL effectors) получают из белков секретируемых бактерией Xanthomonas паразитирующей на растениях ([xxxiii] ,[xxxiv], [xxxv]) и расщепляющего домена взятого у рестрикционной эндонуклеазы FokI.

Нуклеазы TALEN были использованы для модификации эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ИПСК ([xxxvi]).

     Для внедрения в клиническую практику методов генной терапии требуется очень высокая точность доставки необходимых генов к мишени и чистота (бесследное удаление транспозона после «операции») ([xxxvii]). Значительно приблизиться к таким требованиям позволила методика объединившая технологию PiggyBac (PB) транспозона с технологией цинк-фингер нуклеаз – ZFN, что позволило достичь значительного повышения эффективности генетической терапии ИПСК человека и при этом  фактически избежать загрязнения генома мишени терапии остатками нежелательных последовательностей ДНК ([xxxviii]).

  Помимо вышеизложенного ИПСК человека могут быть использованы для моделирования наследственных болезней человека с целью их изучения ([xxxix],[xl])

Далее см. Способы прямой трансдифференцировки соматических взрослых клеток

Литературу можно скачать  
Скачать с сервера (141.0Kb) ]


Категория: Мои файлы | Добавил: анатомнет
Просмотров: 922 | Загрузок: 121 | Рейтинг: 0.0/0
Всего комментариев: 0
Имя *:
Email *:
Код *:
Поиск
Друзья сайта
  • Официальный блог
  • Сообщество uCoz
  • FAQ по системе
  • Инструкции для uCoz
  • Copyright MyCorp © 2018
    Бесплатный хостинг uCoz