Весьма заманчива перспектива использования технологии генной
терапии с помощью ИПСК. ИПСК предоставляют уникальную возможность взять
небольшой образец соматических клеток у пациента (из кожи или клеток мочи) и,
перепрограммировав их в ИПСК произвести
неограниченное количество клеток путем культивации. Затем исправить их, внедрив
в геном «терапевтические гены», которые возьмут на себя функции генов, которые
отсутствуют или неисправно функционируют у пациента. Такие исправленные ИПСК
можно далее использовать для автологичной клеточной терапии путем репопуляции
пораженных тканей ([i]). Таким образом,
корректируя геном, можно будет лечить наследственные болезни вызванные
мутацией.
Эффективная генная
терапия стала возможной после разработки сравнительно безопасных методов
доставки в клетку желаемых инородных генов с минимальным риском побочных
результатов. Одним из способов доставки или вырезания генетических конструкций
является использование ДНК рекомбиназ – ферментов катализирующих рекомбинацию
между молекулами ДНК ([ii]). Так, Cre рекомбиназа, получаемая из
бактериофага P1, осуществляет
гомологичную рекомбинацию между последовательностями известными как LoxP сайты
([iii]). Последовательность ДНК заключенная
между прямыми повторами LoxP сайтов при рекомбинации осуществляемой Cre
рекомбиназой вырезается ([iv]). Доставить Cre рекомбиназу в ядро
можно с помощью бактерий Pseudomonas aeruginosa , которые обладают секреторной
системой типа III (a type III secretion
system - T3SS). Эта система позволяет им
впрыскивать непосредственно в клетку токсичные белки с N-концевой сигнальной
последовательностью, диктующей клетке,
что данный белок должен быть доставлен в ядро ([v]).
Используя Cre рекомбиназу ([vi]) с последовательностью ядерной
локализации (Cre recombinase containing a nuclear localization sequence - Cre-NLS) можно проводить рекомбинацию просто
заражая клетки. При этом простое добавление
антибиотика полностью уничтожает все бактериальные клетки. Такой метод, позволяет, к примеру, убрать из
клеток кассету с факторами, использованными при перепрограммировании
непосредственно в организме – in vivo ([vii]).
Иногда Cre рекомбиназу используют совместно с Помощник-зависимым
аденовирусным вектором Helper-dependent adenoviral vector (HdAd), который
получают путем удаления всех вирусных генов оставляя только обратные
(инвертированные) концевые повторы, необходимые для размножения, и последовательность
Ψ необходимую для упаковки. Такая
стратегия полностью исключает образование токсичных вирусных белков в
зараженной клетке ([viii]).
Привлекательным методом
невирусной доставки генов, который позволяет эффективно встраивать желаемую ДНК
в геном различных клеток является использование транспозонов – сложных структур
содержащих дискретные куски ДНК, обладающие способностью изменять свое
местоположение в геноме посредством механизма транспозиции (инсерции),
вынуждающего его включиться или наоборот покинуть определенный участок генома ([ix] ,[x]).
Транспозон состоит из инсерционных сегментов ДНК, которые могут перемещаться
как единое целое, захватывая лежащие между ними гены.Рис 6, Рис 5. Поэтому перемещение генов
с помощью транспозонов является
многообещающим подходом к решению задач генной терапии. Описано несколько
транспозонных систем пригодных для транспортировки генов в клетки
млекопитающих. Это «Спящая красавица» - Sleeping Beauty (SB) ([xi]) и
его гиперактивный вариант SB100X ([xii]), «Жадный Бак» - PiggyBac (PB) и Tol2
([xiii]).
Так, например, PB был использован для выработки ИПСК путем доставки с
его помощью кассеты генов кодирующих факторы перепрограммирования c-Myc, Klf4, Oct4 и Sox2 в
соматические клетки ([xiv]
). Последующая de novo активация синтеза PB транспосазы (кодируемого самим транспозоном фермента
катализирующего разрыв и воссоединение цепей ДНК) приводила к бесследному
удалению репрограммирующей кассеты ([xv]),
что является бесспорным преимуществом т.к. оставаясь в геноме клетки такой
вектор, мог бы вызвать непредсказуемые нарушения в работе генов. Недостатком этой методики получения ИПСК
является низкая эффективность и возможность мобилизации эндогенных транспозонов.
Позднее была разработана более эффективная методика ([xvi]) получения ИПСК мыши и человека введением в
соматические клетки векторов на основе PiggyBac (PB) с кассетой
из ДНК кодирующей 6 факторов (Oct4, c-Myc, Klf4, Sox2
плюс Rarg (retinoic
acid receptor gamma - RAR-γ) и Lrh-1 (liver
receptor homologue
1; Nr5a2). Этот метод
позволил сократить продолжительность перепрограммирования до 4-12 дней и
поднять его эффективность до уровня сопоставимого с методами переноса ядер ([xvii])
и слияния клеток ([xviii]).
Добавление Rarg –{ гамма рецептора ретиноевой
кислоты (карбоновой кислоты витамина А ([xix]),
при недостаточности которого резко снижается образование гликопептидов
содержащих фукозу ([xx])
– маркер стволовых клеток ([xxi]))}
и действующего синергично с ним Lrh-1 ([xxii]) -
{печеночного рецептора гомолога 1,
называемого также Sf-1 - steroidogenicfactor-1 стероидогенным фактором 1 и являющегося членом
семейства Nr5a - ядерных рецепторов стероидных гормонов} необходимо для
образования гетеродимера Rarg – Lrh1, который, конкурируя против COUP-TF ([xxiii])
за RAREoct (retinoic
acid-responsive elements) локализованные в промотор усиливающем участке
гена Oct4 ([xxiv],
[xxv]),
поддерживает синтез эндогенного Oct4.
Успехи
белковой инженерии позволили создать методы конструирования искусственных
цинк-палец нуклеаз или как их называют в английском звучании цинк-фингер
нуклеаз – ZFN ([xxvi]).
ZFN являются
искусственными рестрикционными ферментами, получаемыми путем внедрения
селективно связывающих ДНК доменов, называемых «цинк-палец», в расщепляющий ДНК
домен неспецифичной рестрикционной эндонуклеазы FokI ([xxvii]), который должен быть удвоен
(димеризован) для того чтобы создать разрывы в обеих цепях двухцепочечной ДНК..
Домен цинк-палец
представляет собой белковую структуру, которая координирует положение ионов
цинка. Он может быть спроектирован таким образом, чтобы узнавать необходимую
последовательность ДНК. ZFN позволяют
редактировать геном, вызывая целенаправленные разрывы в двухцепочечной ДНК.
Двухцепочечный разрыв, позволяет осуществить в участке-мишени ZFN мутагенез в
результате стимулируемой таким образом природной репарации ДНК, а именно
гомологичной рекомбинации и негомологичного соединения концов (Non-Homologous
End Joining - NHEJ). Обычно типичная ZFN
содержит от 2х до 6 «индивидуальных» цинк-пальцев и, в зависимости от
количества пальцев, способна связывать участки ДНК длиной от 5-ти до 18 пар
оснований ([xxviii], [xxix]).
Подобрав достаточно редкие последовательности ДНК в качестве мишени ZFN можно
снизить нежелательную возможность разрезания участков, не предусмотренных в
качестве мишени для нуклеаз ([xxx]).
Кроме ZFN методами биоинженериии получены искусственные
транскрипционные факторы, цинк-палец метиллазы, цинк-палец рекомбиназы.
Разрабатываются и другие биоинженерные нуклеазы, например нуклеазы с ориентируемые доменомTAL (Transcription
Activator-Like Effector Nucleases - TALENs)([xxxi], [xxxii]). Домен TAL (TAL effectors) получают из белков
секретируемых бактерией Xanthomonas
паразитирующей на растениях ([xxxiii]
,[xxxiv], [xxxv]) и
расщепляющего домена взятого у рестрикционной эндонуклеазы FokI.
Нуклеазы TALEN были использованы для модификации
эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
ИПСК ([xxxvi]).
Для внедрения в
клиническую практику методов генной терапии требуется очень высокая точность
доставки необходимых генов к мишени и чистота (бесследное удаление транспозона
после «операции») ([xxxvii]).
Значительно приблизиться к таким требованиям позволила методика объединившая
технологию PiggyBac (PB) транспозона с технологией цинк-фингер нуклеаз – ZFN,
что позволило достичь значительного повышения эффективности генетической
терапии ИПСК человека и при этом
фактически избежать загрязнения генома мишени терапии остатками
нежелательных последовательностей ДНК ([xxxviii]).
Помимо
вышеизложенного ИПСК человека могут быть использованы для моделирования
наследственных болезней человека с целью их изучения ([xxxix],[xl])
Далее см. Способы прямой трансдифференцировки соматических взрослых клеток
| 
