Caenorhabditis elegans крошечный червь, длина которого достигает 1 мм. Он имеет сравнительно несложное анатомическое строение (рис 10). Несмотря на то, что он состоит приблизительно всего лишь из одной тысячи соматических и примерно двух тысяч половых клеток, общий план строения его тела в основных чертах тот же что и у большинства высших животных. Тело его имеет удлиненную форму с билатеральной (двусторонней) симметрией. С апикальной (передней) стороны находится глотка, через которую в кишечник засасываются бактерии, а поблизости от заднего конца – анус для удаления испражнений. Снаружи тело покрыто «кожей» - гиподермой, которую подстилает мышечный слой. Помимо кишечника внутри тела имеется трубчатая гонада, построенная из соматических клеток. Внутри гонады расположены половые клетки. Тело червя прозрачно, что позволяет прижизненно наблюдать деление, миграцию и дифференцировку клеток. C. elegans имеет одну из самых «простых» нервных систем (простыми часто называют нервные системы, состоящие из небольшого числа нейронов). Взрослая гермафродитная особь имеет всего 302 нейрона, связи между которыми были полностью описаны. (White et al, 1986[i])

 

[ Скачать с сервера (41.0Kb) ]

Рис. 12 . Общий план строения Caenorhabditis elegans в основных чертах тот же что и у большинства высших животных

 

 
Генетический аппарат Caenorhabditis elegans расположен на шести парах гомологичных хромосом. В гаплоидном геноме Caenorhabditis elegans примерно в 35 раз меньше ДНК чем у человека. Он имеет длину приблизительно 100 миллионов пар оснований и содержит приблизительно 20 000 генов. Большинство этих генов кодирует белки, но, вероятно, среди них есть примерно 1 000 генов РНК. Благодаря простоте генетического аппарата нематода C. elegans была первым многоклеточным организмом чей геном был полностью прочитан (Stein et al, 2003[ii]). Вышеизложенное сделало C. elegans одним из наиболее удобных объектов для исследования механизмов генетического контроля процессов морфогенеза при развитии и регенерации (Kimble 1981[iii]). В 2006 году двое исследователей Эндрю Файер (Andrew Fire) и Креиг Мелло (Craig C. Mello) были удостоены Нобелевской Премии по физиологии и медицине за разработку метода исследования генов с помощью, так называемых интерферирующих двухцепочечных РНК (double-stranded RNA interference) – dsRNAi (Fire et al., 1998[iv]). В 1998 году они показали, что введение двуцепочечной РНК в организм круглого червя Caenorhabditis elegans приводит к снижению активности гена мишени с ДНК комплементарной к данной дцРНКи. Результатом этой работы стало появление метода и термина РНК-интерференция (Boutros et al.,2004[v]) . Синтетическую двуцепочечную РНК, комплементарную заданному гену, вводят в клетку или организм, где чужеродная молекула РНК запускает систему РНК-интерференции. Этот метод позволяет исследователям значительно снижать уровень экспрессии соответствующего гена. Изучение последствий снижения экспрессии интересующего гена позволяет выяснить физиологическую роль продукта данного гена-мишени. Так как система РНК-интерференции не может полностью выключить экспрессию гена, данный метод называется «нокдауном гена» — в отличие от полного удаления гена, «нокаута гена»( Voorhoeve , Agami 2003[vi]). В дальнейшем был выяснен механизм этого явления. Оказалось, что экзогенная (чужеродная) двуцепочечная РНК запускает систему РНК-интерференции, активируя рибонуклеазу Dicer которая разрезает длинные молекулы дцРНК (dsRNA) на короткие фрагменты порядка 21-23 нуклеотидов, называемые siRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплекса RISC (RNA-induced silencing complex). В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется с комплементарной последовательностью 3’концевого нетранслируемого участка молекулы мРНК и вызывает либо разрезание мРНК белком Argonaute, либо иным образом вызванное ингибирование ее трансляции. Экзогенная двуцепочечная РНК узнаётся и связывается специальными эффекторными белками (например, RDE-4 у Caenorhabditis elegans), усиливающими активность белка Dicer. Такие РНК-связывающие белки облегчают перенос siRNA к комплексу RISC. Путь инициации РНК-интерференции в клетке может быть усилен в результате синтеза «вторичных» siRNA на матрице «первичных» малых интерферирующих РНК с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы (англ. RNA-dependent RNA Polymerase, RdRP). Организмы отличаются по способности воспринимать чужеродные двуцепочечные РНК и использовать их в процессе РНК-интерференции. Эффекты РНК-интерференции у растений и Caenorhabditis elegans (но не у млекопитающих) могут наследоваться. Система РНК-интерференции является важной частью иммунного ответа к вирусам и к другому чужеродному генетическому материалу. Показано что при вирусной инфекции у Caenorhabditis elegans повышается экспрессия белков Argonaute при этом черви, в организме которых повышается экспрессия генов белка Argonaute, активируют пути РНК-интерференции и приобретают устойчивость к вирусной инфекции (Lu et al.,2005[vii],Wilkins et al., 2005[viii]). Предполагается что подобный механизм иммунитета может быть и у млекопитающих о чем свидетельствует тот факт, что некоторые вирусы содержат гены, снижающие ответ системы РНК-интерференции в клетках млекопитающих. Так, например, РНКi, экспрессируемые вирусом герпеса, могут вызывать образование гетерохроматина (конденсированного и поэтому неактивного хроматина) и приводить к переходу вируса в латентное состояние (Li et al .,2005[ix]). Caenorhabditis elegans является одним из наиболее часто используемых организмов-моделей для исследований методами функциональной геномики Это связано с тем, что: 1.) нематода C. elegans имеет простую анатомию, достаточно простой генетический аппарат и при этом геном ее полностью прочитан; 2.) эффекты сайленсинга (ингибирования активности от анг. Silence- заглушать) генов у нематоды наследуются; 3.) система RNAi у этого организма работает наиболее эффективно (Kamath, 2003[x]). Доставка дцРНК в нематоду чрезвычайно проста. Нематодам можно скармливать клетки бактерий, например, Escherichia coli, содержащие требуемые дцРНК, которые при этом усваиваются через кишечник. Данный способ доставки РНК с пищей является эффективным с точки зрения эффективности сайленсинга генов и одновременно намного более дешёвым, простым и быстрым, чем инкубация червей в растворе, содержащем дцРНК или введение дцРНК в гонады (Fortunato, Fraser, 2005[xi]); 4.) именно на C. Elegans разработана мощная и эффективная методика для безболезненного и высокоселективного ингибирования функций микроРНК in vivo (Zheng et al.,2010[xii], Kundu, Slack 2010[xiii]). У большинства других организмов доставка дцРНК связана с многочисленными сложностями и намного более трудоёмка. Тем не менее принимались попытки крупномасштабного исследования геномов и в культурах клеток млекопитающих (Cullen , Arndt 2005[xiv]) Разработке метода РНК-интерференции предшествовало открытие в 1993 году у нематоды Caenorhabditis elegans эндогенно экспрессируемых (т.е. синтезируемых самим организмом) микроРНК (miRNA), которые способны избирательно подавлять экспрессию генов ( Lee, et al, 1993[xv]). Помимо C.elegans аналогичные миРНК были найдены практически у всех многоклеточных организмов (Carrington , Ambros 2003[xvi]). Позднее выяснилось, что эндогенно экспрессируемые миРНК могут играть важную роль в пост-трансляционной регуляции синтеза белков (Selbach et al, 2008[xvii], Baek et al, [xviii]) и процессах регуляции морфогенеза ([xix], Grillari, Grillari-Voglauer 2010[xx]). Возможно миРНК участвуют также в регуляции процессов старения, что было показано в экспериментах с долгоживущими и недолго живущими мутантами C.elegans (Honjoh, Nishida 2011[xxi],Shin et al, 2011[xxii]). Были найдены мутанты у которых была снижена активность одного определенного гена, что приводило к существенному увеличению продолжительности жизни организма. Это говорит о том, что существуют гены регулирующие продолжительность жизни. К числу таких генов, очевидно, относятся гены снижающие активность инсулин/IGF- подобной сигнализации и сигнализации TOR. Учитывая тот факт, что существует значительное сходство между процессами старения у C.elegans и у человека эти данные могу способствовать выявлению возможной роли miРНК в процессах биомаркировки возрастных изменений организмов и разработке способов борьбы с функциональными расстройствами, вызванными старческим дряхлением (Kashyap, 2011[xxiii]) Большинство миРНК представлено уникальным классом коротких РНК, синтезированных на не кодирующих белки последовательностях, так называемой «молчащей» ДНК. Гены миРНК встречаются как в виде единичных генов, так и в виде кластеров (групп) генов. Нередко они имеют свои промоторы (участки необходимые для узнавания РНК-полимеразой точки начала транскрипции) и другие регуляторные участки. Некоторые миРНК находятся на участке интронов (вставок которые не кодируют аминокислотную последовательность белка и после транскрипции вырезаются в ходе процессинга первичного транскрипта в мРНК) принадлежащих генам кодирующим белки. Вначале миРНК транскрибируется в виде длинных первичных транскриптов.Затем они подвергаются процессингу сначала в ядре, а затем в цитоплазме. Образовавшиеся в результате молекулы РНК длиной в 21-23 нуклеотида включаются в комплекс RISC, а затем взаимодействуют с комплементарными 3’концевыми нетранслируемыми участками молекулы информационной РНК. Это приводит либо к деградации РНК мишени, либо к ингибированию ее трансляции в белок. Важно отметить что одна и та же последовательность миРНК может воздействовать на многие мРНК мишени. Такая способность контролировать экспрессию множества генов делает миРНК ключевым звеном в регуляции различных жизненных процессов включая развитие, регенерацию, метаболизм, старение, и т.д. Так, например обширный класс эндогенных миРНК (endo-siRNA) называемых 22G-РНК необходим для поддержания нормальной работы генетического аппарата (Gu et al., 2009[xxiv]) и правильной сегрегации хромосом (Claycomb et al., 2009[xxv]) [i] White JG, Southgate E, Thomson JN, Brenner S (1986) The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil. Trans. Royal Soc. London. B 314, 1-340
[ii] Stein, L. D. et al. (2003). The Genome Sequence of Caenorhabditis briggsae: A Platform for Comparative Genomics. PLoS Biology 1: 166-192
[iii] Kimble J.E. (1981) Strategies for control of pattern formation in Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol)., 295, 539-551
[iv] Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C (1998). "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans". Nature 391 (6669): 806–11. doi:10.1038/35888. PMID 9486653
[v] Boutros M, Kiger A, Armknecht S, Kerr K, Hild M, Koch B, Haas S, Paro R, Perrimon N (2004). "Genome-wide RNAi analysis of growth and viability in Drosophila cells". Science 303 (5659): 832–5.
[vi] Voorhoeve PM, Agami R (2003). «Knockdown stands up». Trends Biotechnol. 21 (1): 2–4.
[vii] Lu R, Maduro M, Li F, Li H, Broitman-Maduro G, Li W, Ding S (2005). «Animal virus replication and RNAi-mediated antiviral silencing in Caenorhabditis elegans». Nature 436 (7053): 1040–3. DOI:10.1038/nature03870. PMID 16107851.
[viii] Wilkins C, Dishongh R, Moore S, Whitt M, Chow M, Machaca K (2005). RNA interference is an antiviral defence mechanism in Caenorhabditis elegans. Nature 436 (7053): 1044–7.
[ix] Li H, Ding S (2005). Antiviral silencing in animals. FEBS Lett 579 (26): 5965–73
[x] Kamath R, Ahringer J (2003).Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans . Methods 30 (4): 313–21
[xi] Fortunato A, Fraser A (2005). Uncover genetic interactions in Caenorhabditis elegans by RNA interference. Biosci Rep 25 (5–6): 299–307
[xii] Zheng G, Ambros V, Li W. (2010) Inhibiting miRNA in Caenorhabditis elegans using a potent and selective antisense reagent. Silence.;1:9.
[xiii] Samrat T Kundu, Frank J Slack (2010) Robust and specific inhibition of microRNAs in Caenorhabditis elegans J Biol.; 9(3): 20. doi: 10.1186/jbiol230 PMCID: PMC2871512
[xiv] Cullen L, Arndt G (2005). «Genome-wide screening for gene function using RNAi in mammalian cells». Immunol Cell Biol 83 (3): 217–23
[xv] Lee R, Feinbaum R, Ambros V (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75 (5): 843–54.
[xvi] Carrington J, Ambros V (2003). Role of microRNAs in plant and animal development. Science 301 (5631): 336–8.
[xvii] Selbach M, Schwanhausser B, Thierfelder N, Fang Z, Khanin R, Rajewsky N. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 2008;455:58–63.
[xviii] Baek D, Villen J, Shin C, Camargo FD, Gygi SP, Bartel DP. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 2008;455:64–71
[xix] Qinghua Liu and Zain Paroo (2010) Biochemical Principles of Small RNA Pathways Annual Review of Biochemistry Vol. 79: 295-319
[xx] Grillari J, Grillari-Voglauer R (2010) Novel modulators of senescence, aging, and longevity: Small non-coding RNAs enter the stage. Exp Gerontol. 2010 Apr;45(4):302-11
[xxi] Honjoh S, Nishida E. (2011) Two sides of life span regulating genes: pro-longevity or anti-longevity? J Biochem. 2011 Mar 3 PMID:21372089
[xxii] Shin H, Lee H, Fejes AP, Baillie DL, Koo HS, Jones SJ (2011) The garlic constituent diallyl trisulfide increases the lifespan of C. elegans via skn-1 activation. BMC Res Notes. 2011 Feb 8;4:34
[xxiii] Kashyap L.(2011) Can microRNAs act as biomarkers of aging? Bioinformation. 2011 Feb 7;5(9):396-7. PMID: 21383908
[xxiv] Gu W, Shirayama M, Conte D Jr, Vasale J, Batista PJ, Claycomb JM, Moresco JJ, Youngman EM, Keys J, Stoltz MJ, Chen CC, Chaves DA, Duan S, Kasschau KD, Fahlgren N, Yates JR, Mitani S, Carrington JC, Mello CC.(2009) Distinct argonaute-mediated 22G-RNA pathways direct genome surveillance in the C. elegans germline. Mol Cell. 2009;36:231–244.
[xxv] Claycomb JM, Batista PJ, Pang KM, Gu W, Vasale JJ, van Wolfswinkel JC, Chaves DA, Shirayama M, Mitani S, Ketting RF, Conte D Jr, Mello CC. (2009) The Argonaute CSR-1 and its 22G-RNA cofactors are required for holocentric chromosome segregation. Cell. 2009;139:123–134